问问广大的bio同学们
有没有做过long range pcr的经验，
或者有做过大片断环形dna阔增的经验更好
n多实际操作的过程中的问题想请教

再顺便问一下，大家有建过EST library的么 [ 本帖最后由 xiaowu 于 2007-11-8 05:58 PM 编辑 ]

引用:

原帖由 xiaowu 于 2007-11-7 12:50 PM 发表
问问广大的bio同学们
有没有做过long range pcr的经验，
或者有做过大片断环形dna阔增的经验更好
n多实际操作的过程中的问题想请教

how long do you want to amplify?

12kb~15kb

long distance PCR就是选一些专门的酶做PCR就好了阿。pcr的条件不同，以你的酶而定。按照酶的protocol做就好。


library这个建议直接买library graded competent cell 来做transformation. 还是不要用自己做的competent cell 了。 [ 本帖最后由 Mindy 于 2007-11-8 08:59 PM 编辑 ]

thermocycle setting 的依据是什么呢，完全按taq的protocol么，还需要注意什么和平时pcr的不同，除了延长延伸时间，
library 如果建的话，在完全没有背景信息的情况下（我这个生物以前几乎没人搞过分子这块），一般情况下难度有多大？你们实验室做么，能不能让偶参观一下，呵呵

Did you mean long fragment PCR? From plasmid?
If correct, I might be able to give some advice.
I am PCRing a 7K fragment from the plasmid and cloning it into gateway system.
It is a little difficult to amplify a long fragment as long as 12-15K, but still doable.
Many things you need to think of in PCR.
The protocol is general, without guarantee of success. If it doesn't work, you need to adjust things by yourself.
The most important thing is enzyme
You need to use a robust enzyme while keeping the PCR high fidelity enough
I used Pfu ultra......it is really bad to amplify large piece although it has high fidelity. My boss just doesn't want to spend money to buy a new enzyme.....so I spent months trying to optimaize all conditions for this enzyme without good results. Finally, I read some other ariticals and many recommed phusion and I borrowed a little fro other lab.....it worked really good!

According to its protocol, it is even more fidelity than Pfu...I added a little (a little will be more than enough) Mg++ to improve the enzyme activity. If you add too much, the fidelity would be impaired. Please note that the extension time for phusion is ~25s/KB which is very diffrent from othe enzyme.

If you use plasmid, give shorter denatureing time like 1min and 10s for each cycle.
BTW, the primer is also a big problem sometimes, You need to check their Tm, GC content, and make sure it wouldn't form primer dimers.....

引用:

原帖由 xiaowu 于 2007-11-7 12:50 PM 发表
问问广大的bio同学们
有没有做过long range pcr的经验，
或者有做过大片断环形dna阔增的经验更好
n多实际操作的过程中的问题想请教

再顺便问一下，大家有建过EST library的么

引用:

原帖由 xiaowu 于 2007-11-9 09:17 AM 发表
thermocycle setting 的依据是什么呢，完全按taq的protocol么，还需要注意什么和平时pcr的不同，除了延长延伸时间，
library 如果建的话，在完全没有背景信息的情况下（我这个生物以前几乎没人搞过分子这块），一 ...

你不是要建库吗？
我以前是先提取RNA，然后作reverse transcription. 这个reverse transcription跟一般的有所不同的是，在cDNA两头都各加了一个adaptor. 然后再用可以paired primer来做PCR. 这样的话，就可以用试剂盒提供的primer了。再加上酶也可以用同一个试剂盒的产品，所以PCR condition基本用公司推荐的parameter就好了。

我大概6，7年前做过。现在的实验室不做这个，没法让你参观了。 [ 本帖最后由 Mindy 于 2007-11-9 01:02 PM 编辑 ]

引用:

原帖由 Mindy 于 2007-11-9 01:00 PM 发表



你不是要建库吗？
我以前是先提取RNA，然后作reverse transcription. 这个reverse transcription跟一般的有所不同的是，在cDNA两头都各加了一个adaptor. 然后再用可以paired primer来做PCR. 这样的话，就可 ...

问个naive的问题，这个paired primer是自己设计的么，还是因为加了着adaptor，利用它来扩的 [ 本帖最后由 xiaowu 于 2007-11-10 09:19 AM 编辑 ]

引用:

原帖由 Nirvana 于 2007-11-9 10:47 AM 发表
Did you mean long fragment PCR? From plasmid?
If correct, I might be able to give some advice.
I am PCRing a 7K fragment from the plasmid and cloning it into gateway system.
It is a little diffi ...

我想扩整个线粒体的，前几天开会看他们就用的outward facing primer就直接给扩出来了，
好像用的是taqLA HS ,是个kit，我估计这个主要是他那个酶比较特殊，可以阔增到１０几个kb以上，　也不知道如果这样的话，pcr的条件要做什么调整，如果完全按kit说的来，会不会太容易了。
我也想这分段扩，然后看overlap连接，这个方法应该比直接全扩更保守些，
你是那个试验室呢，我不在morril，有时间去你那学习学习

引用:

原帖由 xiaowu 于 2007-11-9 08:52 PM 发表


问个naive的问题，这个paired primer是自己设计的么，还是因为加了着adaptor，利用它来扩的

加了adaptor后，就可以用和adaptor配对的pirmer来做pcr. 不难做。这个试剂盒里都有的。
但是，建库来说，这个pcr没有办法定性定量的来检测，只能通过gel大概看看smear的情况，来判断是不是可能p成功了